Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

Cat No. 40302

產品說明書

本產品僅作科研用途！

產品信息

產品描述

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用 FITC 標記了的 Annexin V 作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發生，可用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為 35-36KD 的 Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS 高親和力結合。可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI 是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將 Annexin V 與 PI 聯合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-） 之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被 FITC  和PI  結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

產品組分

編號 組分

產品編號/規格

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒中所有組分均在 4℃保存，勿凍存。Annexin V-FITC、PI 需避光保存。一年有效。

注意事項

1) 由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后 1 小時之內進行分析。

• 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI 攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與 Annexin V-FITC 的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會影響 Annexin

V 與PS 的結合。

3) 實驗中如需要固定細胞，比如在檢測凋亡的同時檢測細胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因為在固定過程中 EGFP 會變性導致喪失激發熒光的能力。固定前需要先將細胞與 Annexin V-FITC 進行孵育，并用binding buffer 洗掉未結合的 Annexin V-FITC。因為固定過程中細胞通透性增加會產生細胞碎片，可以和 Annexin V 結合，對結果產生干擾。

4) 如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有 PS，能與 Annexin  V 結合，從而干擾實驗結果。可以使用含有 EDTA 的緩沖劑并在 200 g 離心洗去血小板。

5) 試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

6) Annexin V-FITC 和PI 是光敏物質，在操作時請注意避光。

操作方法

1.1 樣品染色

1. 懸浮細胞：300g，4℃離心 5 min 收集細胞。貼壁細胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后，300g，4℃離心 5 min 收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2. 用預冷的PBS 洗滌細胞 2 次，每次均需 300g，4℃離心 5 min。收集 1～5×10 ⁵ 細胞。

3. 加入 100μl 1×Binding Buffer 重懸細胞。

4. 加入 5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，輕輕混勻。

5. 避光、室溫反應 10 min。

6.  加入 400μl 1×Binding Buffer，混勻，樣品在 1 小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。注：為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。

1.2 樣品分析

A. 流式細胞儀分析：

FITC 大激發波長為 488 nm，大發射波長 525 nm，FITC 的綠色熒光在 FL1 通道檢測；PI-DNA 復合物的大激發波長為 535 nm，大發射波長為 615 nm，PI 的紅色熒光在 FL2 或FL3 通道檢測。用 CellQuest 等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），FITC 為橫坐標，PI 為縱坐標。每個樣采集 10，000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

B. 熒光顯微鏡分析：

1) 滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。注：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。

2) 在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色，PI 熒光信號呈紅色。

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