超純RNA提取試劑盒說(shuō)明書

Ultrapure RNA Kit

目錄號(hào)：K0581

保存條件：Buffer RLT 2-8℃避光保存。其他組分室溫（15-25℃）保存。

組分說(shuō)明

                   Cat. No.                             K0581

                   Kit Size                              50

                   Buffer RLT                      60 ml

                   Buffer RW1                      40 ml

                   Buffer RW2（concentrate）         11 ml

                   RNase-Free Water                10 ml

                   Spin Column RM                   50

                   Collection Tube（1.5  ml）         50

                   Collection Tube（2  ml）           50

              本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　本試劑盒是基于TRIzon改進(jìn)后的柱式總RNA提取試劑盒，裂解液充分裂解并勻質(zhì)

化樣本，采用*的硅基質(zhì)膜吸附技術(shù)，通過(guò)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下高效專一的結(jié)

合溶液中的RNA，同時(shí)最大限度的有效除去蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽離子及有機(jī)雜質(zhì)等；可從

動(dòng)物組織、植物材料、各種微生物及培養(yǎng)細(xì)胞等樣品中快速提取總  RNA，每次可處理

30-50 mg組織或5×10細(xì)胞，可同時(shí)處理多個(gè)不同樣品。本試劑盒提取得到的RNA可直

接應(yīng)用于RT-PCR、Northern6       Blot、Dot Blot、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)

·純度高：最大限度除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提取的RNA可直接用于下游各種實(shí)驗(yàn)。

·提取量大：*的裂解液配方，充分裂解細(xì)胞或組織，RNA提取量多至100 μg。

·快速：步驟少，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間。

·兼容性強(qiáng)：適用于多種動(dòng)植物組織和細(xì)胞RNA的提取。

自備試劑：氯仿(新開(kāi)封或提取RNA專用)、70%乙醇(無(wú)RNase水配制)、無(wú)水乙醇。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)

1．預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

   1）使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

   2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5  M  NaOH中浸

   泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

   3）配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水。

   4）操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套。

2．樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則影響RNA提取得率和質(zhì)量。

3．使用前若發(fā)現(xiàn)Buffer RLT有沉淀，可置于56℃水浴幾分鐘，即可溶解。

4．第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽說(shuō)明在Buffer RW2中加入無(wú)水乙醇。

5．所有離心步驟若無(wú)特殊說(shuō)明均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動(dòng)作要迅速。

6．若下游實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA非常敏感，建議用不含RNase的DNase  I（貨號(hào)：K2090A）對(duì)

   RNA進(jìn)行處理。

操作步驟

1．樣品處理

   1a.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在Buffer

   RLT中迅速研磨，每30-50 mg組織加入1 ml Buffer RLT，混勻。

   注意：樣品體積一般不要超過(guò)Buffer RLT體積的10%。

   1b.動(dòng)物組織：取新鮮或-70℃凍存的動(dòng)物組織盡量剪碎，每30-50 mg組織加入1 ml

   Buffer RLT，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。或在液氮中研磨后加入Buffer RLT 1 ml混勻。

   注意：樣品體積一般不要超過(guò)Buffer RLT體積的10%。

   1c.單層培養(yǎng)細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，可直接在培養(yǎng)板中加入適量Buffer RLT（每10 cm                                2

   面積需要1 ml Buffer RLT），用取樣器反復(fù)吹打使細(xì)胞裂解。也可用胰蛋白酶處理后，

   將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)

   吸除所有上清，加入Buffer RLT 1 ml混勻。

   注意：1）收集細(xì)胞數(shù)量不要超過(guò)1×10⁷。

   2）Buffer RLT加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果Buffer  RLT加量不足，可能導(dǎo)

   致提取的RNA中有DNA污染。

   3）收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會(huì)導(dǎo)致裂解不*，造成RNA的產(chǎn)量降低。

   1d.細(xì)胞懸液：離心收集細(xì)胞。每5×10⁶   -1×10⁷動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每10⁷細(xì)菌

   注意：細(xì)胞加入1）加入1 mlBuffer Buffer RLT RLT前不要洗。 滌細(xì)胞，以免RNA降解。

   2）一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{儀或液氮研磨處理。

   1e.血液處理：直接取新鮮的血液，加入3倍體積的Buffer RLT（推薦0.25 ml全血加入

   0.75 ml Buffer RLT），充分振蕩混勻。

   1f.可選步驟：對(duì)于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質(zhì)含量高的樣品，如肌肉組織、脂肪組

   織或植物的塊莖，可以在勻漿處理后4℃，12,000 rpm（~13,400×g）離心10分鐘以除去不溶物質(zhì)，此時(shí)沉淀中含胞外物質(zhì)、多糖和高分子量的DNA，而RNA存在于上清中。

2．樣品中加入Buffer  RLT后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白

   核酸復(fù)合物*分離。

3．以每1 ml Buffer RLT加入200 μl氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，

   室溫放置2分鐘。

    4．4℃  12,000  rpm（~13,400×g）離心10分鐘，此時(shí)樣品分為三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色水相， RNA主要在上層水相中，將上層水相移到一個(gè)新的 RNase-

Free離心管（自備）中。

    5．在得到的水相溶液中加入等體積的70%乙醇（無(wú)RNase水配制），顛倒混勻。

    6．將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin

        Column RM）中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    7．向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1，12,000 rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，

        將吸附柱重新放回收集管中。

    8．向吸附柱中加入500  μl Buffer  RW2（使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000

        rpm離心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    9．重復(fù)步驟8。

    10．12,000 rpm離心2 分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，*晾干。

         注意：這一步目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰?huì)影響后續(xù)酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。

    11．將吸附柱置于一個(gè)新的無(wú)RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的

         中間部位加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

         注意：1）RNase-Free Wate體積不應(yīng)小于30 μl，體積過(guò)小影響回收率。

         2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟11。

         3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟11。