過(guò)氧化物酶(POD)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格：100T/96S 產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 0.2mL×1 瓶，4℃保存；用時(shí)加入 3mL 試劑一，現(xiàn)配現(xiàn)用，可 4℃保存一周； 試劑三：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。POD 在有過(guò)氧化氫存在的情況下，能使愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在 470nm 有最大光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。二、測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 測(cè)定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。

3、 樣本測(cè)定表

在 EP 管中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，立即取 200µL 轉(zhuǎn)移至微量玻璃比色皿或 96

孔板中，記錄 470nm 下 30s 時(shí)的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計(jì)算?A＝A2-A1。

POD 活性計(jì)算：

用微量玻璃比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按血清（漿）體積計(jì)算

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mL）＝?A÷0.01×V 反總÷V 樣÷T =4900×?A

2、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝?A÷0.01×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =4900×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝?A÷0.01×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =4900×?A÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝?A÷0.01×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =9.8×?A

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按血清（漿）體積計(jì)算

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mL）＝?A÷0.005×V 反總÷V 樣÷T =9800×?A

2、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝?A÷0.005×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =9800×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝?A÷0.005×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =9800×?A÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.005 定義為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝?A÷0.005×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =19.6×?A

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.245mL；V 樣：加入樣本體積，0.005mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

1、 如一次測(cè)定的樣本數(shù)量較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按照比例混合，在 37℃（哺乳動(dòng)物） 或

25℃（其它物種）放置 10min，測(cè)定時(shí)加入 240µL 即可。

2、 樣本測(cè)定值如果小于 0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 3-5 分鐘，計(jì)算時(shí)除以反應(yīng)時(shí)間即可；如果高于 0.5，可將樣本用提取液進(jìn)行稀釋。計(jì)算時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。

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