替米考星

快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

一、原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物替米考星將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)替米考星抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物替米考星的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物替米考星的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.5ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時(shí)間：       20min～10min

u 樣本檢測(cè)下限

組     織 ·······································  100ppb

u 交叉反應(yīng)率

替米考星 ·········································  100%

u 樣本回收率

組     織 ······································· 95±30%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱、打印機(jī)

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

需要的試劑：濃鹽酸、氫氧化鈉

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液1 0.2M 鹽酸

      取17.2ml濃鹽酸加去離子水定容至1L。

配液2 1M 氫氧化鈉

      稱4g氫氧化鈉固體加去離子水定容至

      100ml。

配液3  樣本提取液

      去離子水與5X樣本提取液按4：1比例混

      合均勻。

u 樣本處理：

（a） 組織（肌肉、肝臟、脂肪）樣本處理方法：

1、取0.5g±0.05g粉碎后的樣本于15ml離心管中；

  加入1ml 0.2M鹽酸（見(jiàn)配液1），充分振蕩3min；

2、再加入200ul 1M 氫氧化鈉 （見(jiàn)配液2）溶液和

  800ul樣本提取液（見(jiàn)配液3），充分振蕩3min，

  20℃ 4000r/min以上離心10min；

3、取上清50µl，加入950µl樣本提取液（見(jiàn)配液

  3），以1：19比例稀釋，充分振蕩混勻；

4、取50µl用于分析。

  樣本稀釋倍數(shù)：100倍    

注： 肌肉組織樣本如因檢測(cè)限要求不同時(shí)可將上清液按不同比例稀釋以得到較合適的檢測(cè)范圍，如取上清100µl，加入300µl樣本提取液，此時(shí)樣本稀釋倍數(shù)為20倍，試劑盒檢測(cè)范圍為10ppb---

810ppb。

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測(cè)定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、 所有恒溫孵育過(guò)程，避免光線照射，用蓋板膜

   蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。

3、 配液：將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)20min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干，用稀釋后的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色10min。

8、 測(cè)定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，5min內(nèi)讀數(shù)），測(cè)定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含替米考星量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.2，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.005； 0.5ppb為1.643；1.5ppb為1.19；4.5ppb為0.67；13.5ppb為0.26；40.5ppb為0.13。則樣本1的濃度范圍是13.5ppb～40.5ppb；樣本2的濃度范圍是1.5ppb～4.5ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中替米考星實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以替米考星標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中替米考星實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來(lái)電索取）

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。

從2011年開(kāi)始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤(rùn)色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

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