實(shí)驗(yàn)意義

熒光定量PCR (Realtime fluorescence quantitative PCR, qPCR)也稱作實(shí)時熒光定量PCR。就是在PCR的擴(kuò)增過程中，通過熒光的信號，對PCR的進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時的定性、定量檢測， 后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對初始模板進(jìn)行定量分析的方法。

檢測方式有SYBR Green染料法和Taqman探針法兩種方式。

探針法與染料法的優(yōu)缺點(diǎn)

1.探針法通過探針可以增加反應(yīng)收集信號的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號，能夠用多重體系反應(yīng)的方法，能夠預(yù)測和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化,缺點(diǎn)是要合成探針，成本高，周期長。

2.染料法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點(diǎn)就是特異性沒有探針法好。

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集及保存方法：

1：病理標(biāo)本收集及保存：

1）冰凍切片：取下適當(dāng)?shù)慕M織塊放于液氮保存；  

2）石蠟切片：取下適當(dāng)?shù)慕M織塊放于4%多聚甲醛保存；

3）細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定30min，換PBS浸沒4℃保存。

2：分子生物學(xué)標(biāo)本收集及保存：

1）新鮮組織：切割標(biāo)本后放于液氮或者-80℃冰箱保存；            

2）石蠟標(biāo)本：常溫保存；

3）全血標(biāo)本：取適量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管；          

4）體液標(biāo)本：高速離心取沉淀；

5）細(xì)胞標(biāo)本：細(xì)胞加TRizol裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。

3：蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集及保存：

1）新鮮組織：切割標(biāo)本后放于液氮或者-80℃冰箱保存；    

2）全血標(biāo)本：取適量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管；      

3）細(xì)胞標(biāo)本：細(xì)胞加細(xì)胞裂解液充分裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。

4：ELISA、放免、生化實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集及保存：

   1）血清（血漿）樣本：取全血加入促凝管（抗凝管），2500轉(zhuǎn)離心20分鐘左右，收集上清，液氮或者-80℃冰箱保存；

   2）尿液樣本：樣本2500轉(zhuǎn)離心20分鐘左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液參照此實(shí)行；

3）細(xì)胞樣本：檢測分泌性的成份時，樣本2500轉(zhuǎn)離心20分鐘左右，液氮或者-80℃冰箱保存；檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS稀釋細(xì)胞懸液，通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，2500轉(zhuǎn)離心20分鐘左右，收集上清同上；

4）組織樣本：切割標(biāo)本后，稱取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?/span>。

5：代謝組學(xué)標(biāo)本收集：

   1）尿液樣本：樣本2500轉(zhuǎn)離心20分鐘左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液等參照此實(shí)行；

   2）組織樣本切割標(biāo)本后，稱取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?/span>；

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