人游離血紅蛋白（F-Hb）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿,組織及相關(guān)液體樣本中游離血紅蛋白（F-Hb）的含量。

實驗原理：

   本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人游離血紅蛋白（F-Hb）水平。用純化的人游離血紅蛋白（F-Hb）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入游離血紅蛋白（F-Hb），再與HRP標(biāo)記的F-Hb抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的游離血紅蛋白（F-Hb）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人游離血紅蛋白（F-Hb）濃度。

試劑盒組成：

操作步驟

1.         標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為360μg/ml，240μg/ml ，120μg/ml， 60μg/ml， 30μg/ml）。

2.         加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液50μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.         溫育：操作同3。

8.         洗滌：操作同5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.     終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.     測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1．  試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．  濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．  各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．  底物請避光保存。

7．  嚴(yán)格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．  本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。

計算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，   

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD     

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)      

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%

檢測范圍：                                             

20μg/ml -400μg/ml 

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月